天津风险投资机构:甲基绿－派罗宁染液怎样配制？

器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧片、培养皿、吸管、镊子、刀片或切片机、分液漏斗等.

试剂： (1)甲基绿的精制：市售的甲基绿中含有甲基紫，甲基紫溶于氯仿，可用萃取法除去甲基紫，方法：先配制2％甲基绿水溶液，置于分液漏斗中，然后加氯仿洗涤数次，弃除氯仿，反复多次直至氯仿层中不显紫色，水层备用。

(2)派罗宁的精制：先配制5％水溶液，置于分液漏斗中，用氯仿洗涤数次，待氯仿不显红色为止，弃除氯仿水层备用。

(3)0.2mol/L醋酸缓冲液，pH4.8(0.2mol/L醋酸40ml+0.2mol/L醋酸60ml)。

(4)甲基绿—派罗宁溶液：1ml2％甲基绿水溶液+1.75ml派罗宁水溶液+pH4.80.2mol/L醋酸缓冲液25ml+水25ml，混合液可保存一周。

组织化学是以鉴定器官，组织和细胞中化学物质和酶类的种类,以及确定它们分布和位置为主要内容的实验技术。组织和细胞内的成分可通过某种呈色的化学反应加以鉴定和定位。植物细胞内最主要的成分有碳水化合物、脂肪、蛋白质和核酸。本实验学习鉴定这些物质及其在细胞内的定位的方法。

一、碳水化合物的鉴定

[原 理] 过碘酸-锡夫反应，简称PAS(Periodic acidSchi)反应。其试剂能与多糖(淀粉、纤维素、半纤维、果胶)、中性粘多糖、糖蛋白、糖脂类以及不饱和脂类和磷脂等反应。 过碘酸是一种氧化剂，它可被乙二醇氧化为乙二醛，使1，2-二元醇类氧化，CC键断裂产生醛，并使醛不再进一步氧化，

反应如下： HO-CH2-CH2-OH+2HIO4→CHO-CHO+2HIO3+2H2O

乙二醇过碘酸乙二醛碘酸 RCHCHR′+HIO4→RCHO+R′CHO+HIO3+H2O 二元醇类醛类醛类产生的醛可与锡夫试剂结合产生红色复合物，反应所产生的颜色深度决定于1,2-二元醇类化合物量的多少。

锡夫试剂是由下列药品反应产生:

[器材与试剂] 器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧杯、培养皿、吸管、镊子、刀 片或切片机。

试剂：过碘酸溶液：0.5g过碘酸溶于100ml蒸馏水中，或者按下配制，过碘酸0.8g，95％乙醇70ml，醋酸钠0.27g，水20ml。

锡夫试剂： 称取0.25g碱性品红于50ml蒸馏水中，冷却后通入SO2，直到碱性品红颜色消失为止，然后用蒸馏水稀释250ml即成。或者按下制取：0.5g碱性品红加到100ml煮沸的蒸馏水中(用三角瓶盛)，经常摇动，煮5分钟(勿使之沸腾)，使之充分溶解，然后冷却至室温，加入0.5gNa2S2O5或K2S2O5或NaHSO3。塞紧瓶塞摇动，在室温下静置12天，使其颜色退至淡黄色，加入0.5g活性碳，用力振动2分钟，用粗滤纸过滤，得无色清液，装瓶密封，贮于4℃冰箱备用。 2％亚硫酸氢钠溶液。

[方法与步骤]

1.将待检材料做成切片，(脱腊过的石蜡切片，冰冻切片或徒手切片均可)。

2.将切片放入过碘酸溶液中，30℃下处理1小时左右。

3.吸去过碘酸溶液，用水或70％乙醇洗涤。

4.在锡夫试剂中染色15分钟左右(如室温过高则要在冰箱内进行，防止锡夫试剂中释放而使试剂失效)。

5.切片用2％亚硫酸钠液洗涤2次，再用流水冲洗5分钟，最后镜检，切片的紫红色处表示有多糖的存在。 注意事项 按上述操作，细胞中水溶性糖类已丧失，被染色的是不溶性的碳水化合物。

二、脂类物质的鉴定 [原 理] 苏丹染料在脂类物质中的溶解度大于其在溶剂中的溶液度，如果染料含有脂的试样接触，便有大量染料进入脂类物质的结构内，使这些结构呈红色。

[器材与试剂] 器材：器材同前。 试剂：苏丹染色剂：1g苏丹Ⅲ和1g苏丹Ⅳ放入干净的棕色瓶中，加入15ml丙酮和15ml70％乙醇组成的混合液，振荡数分钟，放置1224小时使其溶解至饱和，使用上清液，保存需严密加盖，防止蒸发。 苏木精液：10mg苏木精溶于20ml无水乙醇中，加水40ml70％乙醇。

[方法与步骤]

1.将待鉴材料的切片放入苏丹染色剂中，在30℃下染色35分钟。

2.吸去苏丹染色剂，用70％乙醇洗涤，然后用蒸馏水洗去乙醇。

3.吸干水后加入苏木精溶液(以浸没切片为宜)，在30℃下复染1015分钟。

4.镜检：脂类物质呈橙红色，尤其油滴更为清晰。

三、蛋白质的鉴定

(一)显示SH基的铁氰化物法

[原 理] 新制备的铁氰化物(或铁氰酸盐)，在pH2.4的酸性介质中被细胞中的SH基还原成亚铁氰化物。

2〔Fe(CN)6〕-3+2RSH→2〔Fe(CN)6〕-4+RS-SR+2H+ 亚铁氰化物与三价铁结合形成普鲁士蓝沉淀。

4Fe+3+3〔Fe(CN)6〕-4→Fe4〔Fe(CN)6〕3↓

[器材与试剂] 器材：器材同前。

试剂：碱性乙醇液：0.1gNaOH+100ml3％乙醇。 铁氰化物试剂：1％FeCl3·6H2O(新配)3份加0.1％K3Fe(CN)6(新配)1份，调节pH2.4，此试剂需在临用前配制。

[方法与步骤]

1.将切片置铁氰化物试剂中，在30℃下染色510分钟。

2.吸去染色液，用碱性乙醇液洗涤半分钟(如蓝色迅速褪去，可缩短时间)，使背景组织和弥散性蓝色减少。 3.迅速吸去碱性乙醇液，用蒸馏水洗涤。

4.镜检：呈普鲁士蓝的地方表示含有SH基，即为蛋白质处。

(二)双缩脲反应法

[原 理] 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，在碱性溶液中其能 与硫酸铜反应产生红色或蓝紫色的络合物，这反应称双缩脲反应，通过双缩脲反应可鉴定蛋白质的存在。

[器材与试剂] 器材：器材同前。 K试剂：5％CuSO4溶液、25％NaOH溶液。

[方法与步骤] 将待测材料(如浸种过的大豆种子)切片置于滴有5％CuSO4溶液的载玻片上，510分钟后，吸去多余的CuSO4溶液，再滴上12滴25％NaOH溶液，加盖玻片，用水蒸汽加热23分钟，冷后镜检，凡蛋白质处呈蓝紫色。

四、核酸的鉴定

(一)甲基绿-派罗宁法鉴定DNA、RNAJ

[原 理] 核酸分子因含有磷酸根呈酸性，它们对碱性染料甲基绿和派罗宁具有亲和力，但这两种碱性染料具有选择性。RNA易被派罗宁染成红色，而DNA被甲基绿染成绿色，故可用来鉴定核酸。

[器材与试剂] 器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧片、培养皿、吸管、镊子、刀片或切片机、分液漏斗等. 试剂：

(1)甲基绿的精制：市售的甲基绿中含有甲基紫，甲基紫溶于氯仿，可用萃取法除去甲基紫，方法：先配制2％甲基绿水溶液，置于分液漏斗中，然后加氯仿洗涤数次，弃除氯仿，反复多次直至氯仿层中不显紫色，水层备用。

(2)派罗宁的精制：先配制5％水溶液，置于分液漏斗中，用氯仿洗涤数次，待氯仿不显红色为止，弃除氯仿水层备用。

(3)0.2mol/L醋酸缓冲液，pH4.8(0.2mol/L醋酸40ml+0.2mol/L醋酸60ml)。

(4)甲基绿-派罗宁溶液：1ml2％甲基绿水溶液+1.75ml派罗宁水溶液+pH4.80.2mol/L醋酸缓冲液25ml+水25ml，混合液可保存一周。

[方法与步骤]

1.撕取马铃薯嫩茎的表皮或洋葱鳞茎表皮(12层细胞)，或制作待鉴材料的切片。

2.把表皮或切片置于载玻片上，加甲基绿-派罗宁溶液(以浸没材料为宜)，染色1520分钟。

3.用蒸馏水洗去多余的染液(如染色太深，可用70％乙醇洗涤)。

4.用滤纸吸干水分，用丙酮脱水及分色,20分钟后镜检。

结果：细胞核(DNA)被染成绿色，其中核仁(RNA)被染成红色。

(二)孚尔根法鉴定

[原 理] 在酸性环境(1NHCl，60℃)中，DNA的脱氧戊糖转变为醛的形式，锡夫试剂与醛基反应，产生紫色化合物，此反应可特异地显示核中的DNA。

[器材与试剂] 器材：器材同前。

试剂：(1)锡夫试剂(配法见前)。 (2)10％K2S2O5。 (3)1NHCl：8.3ml浓HCl加水稀释至100ml。 (4)亚硫酸溶液：5ml10％K2S2O5加5ml1NHCl，加水稀释至100ml(也可用2％亚硫酸氢钠溶液代替)。

[方法与步骤]

1.将切片或表皮(马铃薯幼嫩茎)放在盛1NHCl的烧杯中，在60℃水浴中放置10分钟左右。

2.冷却后用水洗涤，并吸去水分。

3.加入锡夫试剂，使材料浸没，在室温下染色3060分钟。

4.用亚硫酸液洗涤三次，每次约1分钟。

5.用水洗涤后镜检。

结果：细胞核呈红色，而核仁无色。