海川化工论坛成立时间:抗坏血酸相关酶活性的测定

一、抗坏血酸含量测定
【仪器与用具】

离心机;分光光度计;研钵;试管。

【试剂】

5%三氯乙酸(TCA);

20%TCA;

无水乙醇溶液;

0?4%磷酸-乙醇溶液;

0?5%BP-乙醇溶液;

0?03%FeCl3-乙醇溶液;

0?6g/L DTT;

NA2HPO4-NAOH溶液:以0?2Mol/L NA2HPO4和1?2Mol/L NAOH等量混合;

60MMol/L DTT-乙醇。
【方法】

1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg/L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1?0Ml于试管中，加入1?0Ml 5%TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0?5Ml 0?4%H3PO4-乙醇、1?0Ml 0?5%BP-乙醇、0?5Ml 0?03%FeCl3-乙醇，总体积5?0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。

2.提取取植物叶片1?0g，按1∶5(W/V)加入5%TCA研磨，4000r/Min离心10Min，上清液供测定。

3.测定

(1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。

(2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0?5Ml 60MMol/L DTT-乙醇溶液，用NA2HPO4-NAOH混合液，将溶液PH调至7~8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0?5Ml 20%TCA，把PH调至1~2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。
【原理】

还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。

实验四 抗坏血酸含量及抗坏血酸过氧化物酶活性的测定

一、抗坏血酸含量测定

【原理】

还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。

【仪器与用具】

离心机；分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

5％三氯乙酸(TCA)；

20％TCA；

无水乙醇溶液；

0?4％磷酸—乙醇溶液；

0?5％BP—乙醇溶液；

0?03％FeCl3—乙醇溶液；

0?6g／L DTT；

NA2HPO4—NAOH溶液：以0?2Mol／L NA2HPO4和1?2Mol／L NAOH等量混合；

60MMol／L DTT—乙醇。

【方法】

1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1?0Ml于试管中，加入1?0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0?5Ml 0?4%H3PO4—乙醇、1?0Ml 0?5％BP—乙醇、0?5Ml 0?03%FeCl3—乙醇，总体积5?0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。

2.提取取植物叶片1?0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min离心10Min，上清液供测定。

3.测定

(1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。

(2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0?5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，将溶液PH调至7～8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0?5Ml 20％TCA，把PH调至1～2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。

二、抗坏血酸过氧化物酶(AsA－POD)活性

【原理】

AsA－POD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化，溶液中290nM波长下的消光值(A290)下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系数2?8(MMol／L)／CM计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol／g·H表示。

【仪器】

离心机；紫外分光光度计；研钵；试管。

【试剂】

50MMol／L K2PO4—KH2PO4缓冲液(PH7?0，内含0?1MMol／L EDTA－NA2)?

0?3MMol／L AsA；

20μMol／L AsA；

0?06MMol／L H2O2。

【方法】

1?酶液制备取1?0g植物叶片剪碎，按1∶3(W／V)加入预冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在4000r／Min下离心10Min，上清液作酶粗提液供测定。

2.酶活性测定3Ml反应混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液(PH7?0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0?06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。

【思考题】

1.抗坏血酸在植物体内有何生理意义?

2.简述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定原理。

哪位师兄知道如何测“脱氢抗坏血酸还原酶”活性的方法。不用试剂盒测。万分感谢！！！

你好，那个脱氢抗坏血酸还原酶活性如何测定